Diseño y desarrollo de técnicas Nano-proteómicas de alto rendimiento para el descubrimiento de biomarcadores y nuevos fármacos empleando como modelo leucemia linfoides B y tirosin quinasa

Objetivos: 1.-Diseno y desarrollo de un array de esferas («beads suspension array»), compatible con un citometro de flujo, para el rastreo dirigido y especifico de los patrones diferenciales proteicos de las distintas subpoblaciones de celulas B neoplasicas muy minoritarias y su contrapartida normal. Incluyendo la evaluacion de los niveles de fosforilacion, complejos proteicos, etc…
2.-Identificacion mediante MS/MS de alta resolucion ( Orbitrap Q-velos) de las regiones variables de las cadenas pesadas de los BCR de las distintas poblaciones de celulas B neoplasicas. 3.-Diseno y construcción de un array NAPPA con tirosinkinasas ( cKIT, BCR-ABL,AKT1,…) y las mutaciones puntuales ( clínicamente mas relevantes en enfermedades hematológicas) para el analisis masivo de inhibidores ( a nivel sustrato o alosterico) de tirosin-kinasas. A su vez, establecer las
posibles relaciones, en capacidad inhibitoria, entre los mutantes puntuales y la forma silvestre. Metodología: Se incluirán un total de 50 individuos ( LLC-B, SLPC-B y sanos). Inicialmente se les proporcionara a todos los individuos un cuestionario de salud y sobre sus muestras de sangre periferica, se realizara el rastreo dirigido de la presencia de celulas B clonales mediante citometria de flujo. En los casos en los que se detecte la presencia de celulas B aberrantes se realizara una amplia caracterizacion molecular de los niveles diferenciales de expresion proteica (mediante arrays de esferas en suspension), las secuencias peptidicas de los fragmentos de IgG de union a antigeno (mediante espectrometria de masas de alta resolucion). Se realizara un estudio funcional mediante NAPPA arrays de tirosin-quinasas y las alteraciones (mutaciones puntuales, delecciones,etc…) con distintos farmacos. Finalmente, se hara la integracion y analisis de los datos obtenidos y correlacion con los hallazgos clinicos y biologicos.